Gut | 成像质谱流式在肝细胞癌肿瘤微环境拓扑分析的应用

肝癌是全球癌症相关死亡的第三大原因，肝细胞癌 (HCC) 是最常见的肝脏原发性恶性肿瘤。酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 治疗疗效仍然有限，免疫检查点抑制剂 (ICIs)，如程序性细胞死亡蛋白-1 (PD-1) 阻断抗体，显示出比 TKI 更高的客观反应率和更少的总体不良副作用。然而与黑色素瘤或淋巴瘤相比，HCC 的 ICI 抗肿瘤活性仅达到中等的客观反应率（15%–20%）。由于 HCC 肿瘤微环境 (TME) 是高度复杂的，具有组成各种功能单元、细胞邻域 (CN) 的多种细胞成分。传统的免疫组化或免疫荧光的方法难以满足多参数检测的需求，从而限制了其在复杂 TME 研究中的应用。成像质谱流式技术（Imaging Mass Cytometry，简称 IMC），利用数十种稀有金属标记抗体，对单个组织切片进行染色，可以同时检测数十种蛋白质和蛋白质修饰，并保留细胞空间信息，确定空间分辨的单细胞表型，即能够实现基于空间分辨率的 HCC TME 表型是 TME 拓扑分析的实用工具。

近日，来自浙江大学梁廷波教授、盛剑鹏研究员带领的研究团队在 HCC 免疫治疗领域获得了突破进展。他们从大量亚细胞空间分辨率的蛋白数据中，首次揭示了 HCC TME 的各种拓扑功能单元，同时提供了最大的 HCC 病理景观库，突出了 Kupffer 细胞特异性靶向而不是整体骨髓细胞阻断作为 HCC 治疗的新型免疫疗法的潜力。研究结果发表在 Gut（IF = 23.06）期刊。 

这项研究利用 IMC 量化了 134 名 HCC 患者和 7 名健康供体的 FFPE 切片样本中 36 个 marker 的表达和定位信息，获得了 562 张亚细胞空间分辨率的高维肿瘤病理图像。图像中包含人肝脏微环境区域独特的组织结构，以及主要基质细胞类型和免疫细胞群（Fig 1）。

Fig 1．IMC 获得正常肝组织包含 36 个 marker 的表达代表性数据的高维图像。(A)marker 单色伪彩图片，箭头 1: B 细胞 (CD3- CD20+)，箭头 2: CD8+ T 细胞 (CD3+ CD8+ CD4-)，箭头 3: 中性粒细胞 (CD11b+ CD68- CD15+)，箭头 4：浸润性巨噬细胞 (CD11b+ CD68+ CD16- CD169low)，箭头 5: kuffer 细胞 (CD11blow CD68+ CD16+ CD169+)，箭头 6: 自然杀伤 (NK) 细胞 (CD68-CD16+ CD57 +)；(B) 描绘肝脏组织结构，左图 Pan-keratin(青色)、αSMA(黄色)、collagen I (蓝色) 和 CD31(红色)，肝细胞呈青色，肝索、肝窦用白色虚线突出；右图 H&E 染色，黑色虚线突出相同结构，比例尺 100 μm。

如何将图像信息解析出来并与临床数据建立联系，成了下—步研究的关键。研究人员对高维数据进行深入挖掘。

HCC 微环境的组织拓扑分析

对于组织拓扑分析，研究人员首先利用 CellProfiler 软件分割出组织图像中的每个细胞，从而得到单细胞水平的 marker 表达数据。将分割数据输入 hisoCAT 软件进行 tSNE 和 Pheno Graph 和细胞邻域（CN）等分析。将组织细胞划分成了 22  个元簇 (metacluster)，包括 3 个肝细胞元簇、4 个癌细胞元簇、2 个内皮细胞元簇、2 个成纤维细胞元簇和 11 个免疫细胞元簇。热图展示每个元簇中 marker 的表达，发现许多非免疫细胞表达 PD-1，且去分化的肝细胞 1 和 2 表达的 PD-1 最高 (Fig 2)。

Fig 2. IMC 数据处理和分析流程。图像单细胞化后，根据单细胞表达数据聚成的 22 个元簇 (A) IMC 数据采集示意图，包括组织制备、抗体染色、图像采集与组装、单细胞识别、细胞降维、聚类和生存分析; (C) 热图显示元簇 marker 的平均表达，右侧箱形图显示其在不同患者中的频率分布模式。

分析了每个肝癌患者样本中的多个区域，在 HCC 中发现了三种主要类型的 TME(I-III 型)，具有不同的基质和免疫细胞分布模式，这些模式对应于肝细胞去分化的不同阶段。I 型：肝细胞标记物, 如 pan-keratin 和 E-cadherin 强表达，肝脏的主要结构, 包括肝窦和肝索保存完整，这表明 I 型区域类似于正常肝组织和癌旁组织；II 型：成纤维细胞标记物，如 αSMA 和 collagenI 在区域高度富集，反映纤维化主要发生在该区域；III 型：肝细胞失去了上皮标记物的表达，如 pan-keratin 和 E-cadherin，提示肝细胞发生去分化，且增殖标记物 Ki-67 在 III 型区域表达水平高于其他区域 (Fig 3A)。CD45+免疫细胞主要存在于 I 型和 II 型区域，而 III 型区域几乎没有这些细胞 (Fig 3B)。这些结果揭示了三种主要类型 TME 和瘤内区域，表现出肝细胞去分化，间质细胞和免疫细胞的区域特异性分布。

Fig 3. 三种主要类型肿瘤内区域的 IMC 图像。（A）E-cadherin (红色),pan-keratin(青色)、Ki-67(绿色) 和 caspase-3(黄色) 的叠加图片，用于识别 HCC 的 I 型、II 型和 III 型区域。黄色和绿色箭头分别表示 Caspase-3 和 Ki-67 染色。（B）αSMA(红色)、collagen I (蓝色) 和 CD45(绿色) 的叠加图观察纤维化区域和免疫细胞分布模式。绿色箭头表示免疫细胞。白色虚线突出纤维化区域。

单细胞分析不同 TME 中细胞的差异分布

作者进一步研究去分化过程与肿瘤微环境变化之间的关系，采用 tSNE 在单细胞水平上分析，并在 tSNE 图中添加元簇 (1-22) 注释 (Fig 4A)。热图分析三种 HCC TME 中元簇频率 (Fig 4B)。肝细胞、成纤维细胞、内皮细胞和不同的免疫细胞群分离成不同的元簇。根据 pan-keratin 和 E-cadherin 的表达减少，在 I 型区域有 2 个肝细胞元簇 (1-2)。元簇 1 细胞显示最强的 pan-keratin 和 E-cadherin 染色，而元簇 2 的肝细胞 pan-keratin 和 E-cadherin 表达减少，提示 I 型区去分化过程开始 (Fig 4C)。II 型区域的元簇 3 去分化肝细胞保持正常水平的 pan-keratin，而 E-cadherin 表达有限 (Fig 4D)。在 III 型区域有三群癌细胞 (元簇 4-6)，缺乏 pan-keratin 和 E-cadherin 染色，代表大部分去分化细胞 (Fig 4E)。因此，对高维 IMC 图像的单细胞分析详细地证实了细胞在 I-III 型区域的差异分布。

Fig 4.  不同区域的细胞组成和功能变化。(A)tSNE 展示 HCC TME 的元簇组成；(B) 不同区域 22 个元簇频率分布热图；(C-E) 分别为 I-III 型区域 tSNE 图

我们生活的城市由不同的社区组成 (如工业、住宅或农业)，社区是城市特定功能发生的区域，如工业产出或能源消耗。在本研究中，TME 相当于城市，而 CN 相当于城市中的社区。作者将 CN 定义为中心细胞 4 μm 内的初级邻近细胞及初级邻近细胞的次级邻近细胞 (Fig 5A)。根据 CN 内的主要细胞簇对 CNs 进行注释，分成了 16 个 CN (Fig 5B)。为了确定 CN 功能单位是否与患者预后相关，作者对拓扑功能单元与患者总生存期 (OS) 和无进展生存期 (PFS) 之间关系进行探索。结合 69 例未接受新辅助治疗或肝移植的患者的 Kaplan-Meier 生存分析，生成每个患者的拓扑图，计算 CN 功能单位频率。发现癌细胞富集的 CN (CN9) 与患者 OS 和 PFS 较差相关，CD8+ T 细胞富集的 CN (CN13) 与患者 OS 延长有关。且 KC-富集的 CN、InfM-CN 与患者预后呈相反关系。高频率 KC 富集的 CN (CN4) 与患者 OS 和 PFS 较差相关，而 InfM-CN (CN7) 较高频率与患者 OS 无显著相关 (Fig 5D)。这些结果表明，肝癌的拓扑功能单位可能成为新的肝癌患者预后生物标志物。此外, KC 和 InfM 组成功能相反的 CNs 肝癌 TME。KC-CN 频率高的患者预后较差，而 infM-CN 频率高的患者预后较好。

Fig 5. 肝细胞癌肿瘤微环境细胞功能单位与患者预后的相关性。(A)CN 分析方法；(B) 13 种主要的 CN 类型首先通过 CN 内的主要细胞类型进行注释，然后通过 CN 中每个细胞类型的缩放频率 (如图 y 轴所示) 进行聚类；(D) 按照 A 所示的程序对患者的 IMC 图像进行拓扑分析，然后计算每个患者的 CN 频率。比较不同类型 CN 频率的高或低与患者的总生存期和无进展生存期的关系。

Kupffer 细胞的耗尽增强肿瘤抗 PD-1 治疗的反应

接下来作者构建小鼠模型，利用 IMC 等技术，证明了肝脏中 Kupffer 细胞的消耗在很大程度上增强了 T 细胞反应，减少了肝脏肿瘤的生长并且肿瘤对抗 PD-1 治疗反应敏感。突出了 Kupffer 细胞特异性靶向而不是整体骨髓细胞阻断作为 HCC 治疗的新型免疫疗法的潜力。

这项研究成功地采用 Fluidigm 的组织成像质谱流式系统对肝细胞癌肿瘤免疫微环境进行深入的拓扑分析。与传统的免疫组化或者免疫荧光不同，IMC 采用金属元素作为抗体的标签，利用质谱系统进行信号的检测。从原理上避免了荧光串色、组织背景等因素对结果的影响，可在一次扫描中同时检测几十种蛋白质，已成为肿瘤微环境拓扑分析的有效工具，是研究健康组织或病理组织的理想手段。

参考文献：

1 Sheng, J.P., Zhang, J.L., Wang L. et al. "Topological analysis ofhepatocellular carcinoma tumour microenvironment based on imaging mass cytometryreveals cellular neighbourhood regulated reversely by macrophages withdifferent ontogeny." Gut. 12 July 2021, doi:10.1136/gutjnl-2021-324339.