【Nature】CAR-T 细胞持续缓解白血病的奥秘——质谱流式技术揭示 CAR-T 细胞的表型和功能

图 a. 媒体新闻报道[1]

在这项研究中，Carl June 实验室应用了 Fluidigm CyTOF 质谱流式技术，对 CAR-T 细胞的表型和功能进行了深入且长期的追踪研究，以下，我们就为您就这项研究成果做详细介绍。」

[1] 新闻引自：

《搜狐网》https://www.sohu.com/a/520537897_121124565

《腾讯网》https://new.qq.com/rain/a/20220203A0245700

《新浪财经》https://cj.sina.com.cn/articles/view/5044281310/12ca99fde02001r4be

CAR-T 疗法，即嵌合抗原受体 T 细胞免疫疗法，是将患者的 T 淋巴细胞（具有天然抗感染和抗癌作用）分离出来，通过基因重新编辑让 T 淋巴细胞带上能够识别肿瘤细胞抗原的受体，并进行大规模的体外扩增 CAR-T 细胞，再回输到患者体内，CAR-T 细胞便会特异性地攻击肿瘤细胞，从而快速、精准地治疗肿瘤。CAR-T 疗法在多种癌症中显示了治疗潜力。然而，对输入体内的 CAR-T 细胞的长期潜力和克隆稳定性知之甚少。

2022 年 2 月 2 日，宾夕法尼亚大学 & 费城儿童医院的研究人员在 Nature 杂志在线发表了题为 Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4+ CAR T cells 的文章【1】，并受到了广泛的关注。作者利用 Fluidigm 质谱流式技术（CyTOF）和 CITE-seq 等多组学技术深入分析了 CAR-T 治疗不同阶段患者体内的 CAR-T 细胞特性和变化，首次揭示了长期持久 CAR-T 细胞的特征。

作者利用质谱流式，设计了由 40 个 markers 组成的 panel，其中 35 个 marker（表面和胞内）用于识别 T 细胞, 另外 5 个 marker 用于去除非 T 细胞。对两位十年前首批接受 CAR-T 治疗后获得完全缓解的慢性淋巴细胞白血病患者进行跟踪检测。

患者 1 中，CAR-T 输入后 1.8 个月，CD8+CAR-T 细胞占比 29.3%，在随后的时间点出现比例下降；CAR-T 细胞输入后 1.4 年，CD4+ CAR-T 细胞占比 97.5%；CAR-T 细胞输入后 3.4 年到 9.3 年；CD4+ CAR-T 细胞占比 99.6%(图 1a-c)。患者 2 中，以更加延迟的 CAR T 细胞扩增为特征，并表现整体相似的趋势。CD8+CAR-T 在初始时间点为主要的亚群，随后逐渐减少，CAR-T 细胞输入后 7.2 年，CD4+CAR-T 细胞占比 97.6%。同时发现 CD4-CD8-CAR-T 细胞亚群在患者 2 中很明显，CAR-T 细胞输入后 2.5 个月和 1.6 年，分别占总 CAR-T 细胞的 33.4% 和 46.5%；CAR-T 细胞输入后 2.8 年、4.7 年和 7.2 年，分别减少到 12.9%、8.2% 和 0.5%(图 1b, c)。该细胞亚群有着独特的细胞表型，表达细胞毒性标记物 GZMB, 2B4，CD57, CD85j，T-bet 和 PD-1，以及 Helios（Helios--T 细胞活化和增殖的一种标志物-编者注【2】）。这些特征明显地将该亚群与其他类似的细胞毒性 CD8+ T 细胞区分开 (图 1b)。基于这种独特的标记，作者将其标记为 CD4-CD8- Helioshi CAR-T 细胞。该亚群在患者 1 输入 CAR-T 细胞 1.8 月的样本中比率较低 (3.2%)，并在 CAR-T 细胞输入后 1.4 年变得更少 (小于 1%)(图 1c)。

图 1. 质谱流式多个时间点分析 CD3+ CAR-T 细胞。a. UMP 降维分析患者不同时间点的 CD3+ CAR-T 细胞，颜色代表采样时间点；b. 选定细胞标记物的蛋白表达； c. UMAP 降维展示 5 个主要的 CAR - T 细胞群组成，颜色代表细胞亚群；d. 统计分析不同细胞中Ki67的表达；e. CAR - T 细胞亚群中各标记物表达的热图。

CD4+ CAR-T 细胞高表达 Ki67，为增殖表型 (图 1b)。在两例患者中，Ki67 hiCD4+ CAR-T 细胞稳步出现。患者 1 中，CAR-T 细胞输入后 1.8 个月时占总 CAR-T 细胞的 15.9%；CAR-T 输入后 9.3 年增加到 97.0%。患者 2 中，Ki67 hi CD4+ CAR-T 细胞在 CAR-T 细胞输入后 2.4 个月时占 0.2%， CAR-T 细胞输入后 7.2 年增加到 87.2%(图 1b, c)。比较 CAR+ CD4 T 细胞和 CAR- CD4 T 细胞，发现 Ki67 的表达具有很强的 CAR+ T 细胞特异性 (图 1d)。CD8+ CAR-T 细胞整体上也表现出增殖趋势，但是 Ki67 的表达普遍较 CD4+ CAR-T 细胞低且不稳定 (图 1d)。且 Ki67 hi CD4+T 细胞表达了不同的标志物，包括激活标志物 CD38、HLA-DR 和 CD95、转录因子 EOMES 和 TOX、检查点标志物 CTLA-4, LAG-3 和 TIGIT，以及记忆型标志物 CD27 和 CCR7(图 1e)。

综上结果表明两名患者体内的 CAR-T 细胞治疗经历了两个不同的阶段，初始阶段以 CD8+CAR-T 和 CD4-CD8- CAR-T 细胞为主，负责杀伤肿瘤细胞，而长期缓解阶段则以 CD4+CAR-T 细胞为主，负责控制肿瘤细胞，且 CD4+CAR-T 细胞表现出持续增殖和杀伤肿瘤细胞的特性，是持久临床反应的关键特征。想要长久控制肿瘤，也需要多种不同 CAR-T 细胞类型的组合。此项研究为与抗癌反应和长期缓解相关的 CAR-T 细胞特征提供了新的见解，且为 CAR-T 细胞疗法的长期治疗效果和整合到体内的安全性提供了概念证明。Carl June 表示，现在可以认为 CAR-T 确实可以真正治愈白血病。

这项研究成功地运用了 CyTOF 技术，对患者体内 CAR-T 细胞表型和功能进行深入而细致的分析。Fluidigm 公司独有的质谱流式技术是一种高通量单细胞蛋白质分析技术，利用金属元素作为抗体的标签，以质谱作为检测手段，可同时分析单细胞表面和内部的 50 多种标志物，由于采用特殊的金属元素作为检测信号，背景信号极低，彻底解决传统流式的荧光串色的问题，并在多领域得到广泛应用。

参考文献：

1.  Melenhorst J. J.,Chen G. M., Wang M. et al. "Decade-long leukaemia remissions with persistence of CD4+ CAR T cells." Nature. 2022 Feb 2. doi: 10.1038/s41586-021-04390-6.

2.  Tatiana Akimova, Ulf H Beier, Liqing Wang, et al. "Helios expression is a marker of T cell activation and proliferation" PLoS One2011;6(8):e24226. doi: 10.1371/journal.pone.0024226. Epub2011 Aug 30.