近日，加拿大麦吉尔大学古德曼癌症研究所的Logan Walsh团队在《Nature》上发表了名为“Single-cell spatial landscapes of the lung tumour immune microenvironment”的研究。该研究使用Standard BioTools公司的组织成像质谱流式技术（Imaging mass cytometry, IMC）集中分析了肺癌免疫微环境，并通过机器深度学习的方法验证了单细胞空间信息如何帮助预测临床预后。

肺癌在全部癌症死亡病例中占比最高，约为20%。非小细胞肺癌（NSCLC）中的肺腺癌（LUAD）则是最常见的亚型。先前研究表明免疫微环境对肺腺癌进展及治疗响应均有影响，然而人们对该疾病的免疫微环境仍缺乏系统性认知。因此，Walsh团队利用IMC技术破解了肺腺癌免疫微环境。

组织成像质谱流式技术是一项新兴的组织成像技术。该技术利用稳定金属同位素标记的抗体代替传统的荧光素标记抗体对切片进行染色，以飞行时间质谱的检测方式区分不同的金属同位素标签，在极大地增加检测通道的同时彻底解决了荧光基团间严重的串色问题。研究者可在单张切片上同时使用超过30种抗体进行染色，随后使用Hyperion组织成像质谱流式系统在1 μm的亚细胞分辨率上收取所有通道的染色信息并对应到切片的位置上。通过这种方法，研究者能够获得单细胞层面超过30种以上蛋白表达水平及细胞间的位置关系，从而达到深入挖掘细胞表型和功能及分析细胞间位置关系的目的。

得益于该技术强大的功能，本研究共使用了416位病人的组织样品，将每个样品 1mm² 的区域制成组织芯片后用35个抗体的panel进行染色。该panel涵盖了免疫分型、组织结构、增殖、信号通路分子等标志物。研究人员在生成的图片上共检测到超过160万个细胞，通过聚类分析将其归为肿瘤细胞、内皮细胞和14种不同的免疫细胞亚群。
 

图1. IMC解读肺腺癌单细胞空间生物学景观

通过区分肿瘤形态，研究人员发现高分级实体瘤中浸润的免疫细胞最多，并且这主要是由髓系细胞而非淋巴系细胞的变化造成的。其中，巨噬细胞在肺腺癌免疫微环境中的存在尤其突出。

接下来，研究人员揭示了免疫细胞数量与临床变量之间的关系。在去除了影响生存率的其他临床变量的干扰后，与整体生存率最显著相关的免疫细胞指标是B细胞的相对含量。除此之外，细胞含量与其他临床变量的联系也得以建立。 

图2. 细胞量与临床变量的关系及细胞间相互作用

研究人员使用置换检验，通过分析细胞间的距离关系得出了不同细胞亚群间的相互作用。例如，与低分级肿瘤相比，在高分级肿瘤中中性粒细胞和内皮细胞与癌细胞的相互作用明显增加；而在低分级肿瘤中，CD8+和CD4+ T细胞与癌细胞间的关联比在高分级肿瘤中的高。这些数据印证了先前研究中的发现，而且表明细胞间位置关系可能比细胞量本身拥有更大的预后价值。

除细胞数量和相互作用外，研究人员还研究了肿瘤微环境中细胞表型与生存率的关系。尽管中性粒细胞的总量没有影响生存率， HIF1α+中性粒细胞亚群的增多与更差的总体生存率显著相关。增殖性Ki-67+内皮细胞和辅助性T细胞中ERK通路激活则分别对应更短与更长的生存时间。

在充分研究了免疫微环境中细胞亚群与其位置关系的基础上，研究者接下来通过分析每个细胞与其相邻的十个细胞，将细胞分为不同的邻域（cellular neighbourhood，CN）类别。对邻域类别和生存时间的分析证实了特定细胞间相互作用与生存率的关系，再次说明免疫微环境中细胞的组织关系蕴含独特的预后价值。

图3. 细胞表型及邻域类别与生存期的关系

 

最后，研究人员使用机器深度学习的方法进行建模和测试，表明细胞数量本身对临床变量不能进行较好预测。而在模型中输入单细胞位置信息则显著提升了对所有临床变量的预测效果，另外60个病人样本的数据也独立验证了这一模型的能力。这再一次证实肿瘤微环境中包含的信息虽然复杂，但组织成像质谱流式技术可以在 1mm² 的区域内获得充足的数据，解读其中的信息可帮助有效预测病人生存。

 

图4. 机器深度学习IMC数据可预测临床预后

 

Standard BioTools公司的组织成像质谱流式平台是目前仅有的商用IMC平台，已帮助全世界研究人员发表了超过200篇同行评审文章并参与到15项临床试验中。本研究使用每个肿瘤 1mm² 的区域即可捕获详细的免疫图谱并预测生存，足以表明IMC技术在临床研究领域广阔的应用前景。

这篇文章是使用IMC解读肿瘤微环境并帮助预测临床预后的优秀范例。IMC技术具有多通道、单次染色和单次上机的特点，染色流程类似免疫组化，为实验人员便捷地获得单细胞几十种蛋白表达及空间原位信息提供了可能。

参考文献：
Sorin et al. Single-cell spatial landscapes of the lung tumour immune microenvironment. Nature. 2023 Feb;614(7948):548-554.

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