【Nature】双胞胎研究揭示多发性硬化症的非遗传的免疫变化

多发性硬化症是一种中枢神经系统的慢性炎症性疾病，也是以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫病。多发性硬化症的病因学涉及多基因风险变异和环境触发因素之间的复杂相互作用。因此，研究遗传易感性和环境诱因如何塑造个体免疫细胞的相互作用，对于理解包括多发性硬化症在内的自身免疫性疾病的病理生理学至关重要。

2022 年 2 月 16 日，苏黎世大学和慕尼黑大学的研究人员在 Nature 杂志在线发表了题为 Twin study reveals non-heritable immune perturbations in multiple sclerosis 的文章 [1]。作者对 61 对同卵双胞胎进行了深入分析，有趣的是，同卵双胞胎中，一人患有多发性硬化症，而另一人未患有多发性硬化症。同卵双胞胎们携带相同的遗传物质和所处的早期生活环境相同，从而消除了大部分可变遗传以及早期环境对异质人群的影响。作者利用 Fluidigm 质谱流式技术（CyTOF）和 CITE-seq 等多组学技术并结合机器学习算法全面而深入分析双胞胎的免疫系统，并解释为什么两个人具有相同的遗传易感性和受到相同早期环境影响，却能表现出不同的多发性硬化症临床表型 (图 1a)。

作者利用质谱流式技术，设计了 2 个 panel，分别由 37 个 marker 组成，其中一个 panel 由表面蛋白和转录因子组成，对免疫细胞的表型，转运和激活状态进行分析，另外一个 panel 由表面蛋白和 13 个细胞因子组成，对不同类型免疫细胞的细胞因子和转运蛋白的表达情况进行分析。选取多发性硬化症患者和他们未受影响同胞的 PBMCs 样本进行检测，全面分析免疫细胞亚群的变化。为了降低样本间的实验误差，作者使用了 Live Barcode 技术，用带有不同金属标签的 CD45 抗体对样本标记，将几十个样本混在一起进行 panel 抗体染色和数据采集，不仅提高了检测通量，而且使数据更加精准，挖掘出低丰度蛋白的变化。采集的数据通过 FlowSOM 聚类和手动合并簇构建典型免疫细胞群的参考框架，另外结合贝叶斯算法的 diffcyt 工具，共鉴定了 1400 个免疫特征，每个特征代表了给定免疫簇中一个细胞状态标记的表达。从中寻找差异性免疫特征，差异特征需要满足两个条件：1）在所有双胞胎中能够区分多发性硬化症的患者和其健康同胞；2）不是由疾病修饰治疗诱发的 (图 1b)。共鉴定 18 个差异特征即差异状态节点，其中 12 个位于 TH 细胞区域，1 个接近非传统的 T 细胞参考节点，3 个接近自然杀伤 (NK) 细胞参考节点和其余 2 个位于髓系细胞区域 (图 1b)。其中，TH 细胞和髓系细胞群体改变最为显著。
 

质谱流式技术助力研究发现患有多发性硬化症双胞胎的免疫系统特征变化，即环境触发的多发性硬化症免疫改变：

髓系细胞——单核细胞的 CCR2-CSF2R 升高
多发性硬化症相关的单核细胞特征在差异状态节点中发现，单核细胞趋化受体 2(CCR2) 和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 受体特异性亚基 (CD116) 蛋白在患有多发性硬化症的双胞胎中表达水平更高（图 2a)。这种差异状态吞噬细胞节点的表型类似于经典单核细胞 (图 2a)。然而，CD14 表达低，CD16 不表达，阻碍了其归类为典型免疫亚群。CCR2 和 CD116 在未治疗的双胞胎中表达尤其明显，表明这种特殊多发性硬化症相关的变化易受疾病修饰治疗的影响 (图 2a)，且对炎症刺激敏感。

图 2. 患有多发性硬化症的双胞胎的髓系细胞向单核细胞群转移，CCR2 和 GM-CSF 受体的表达增加。

淋巴细胞——T_H 细胞的 CD25 增加

淋巴细胞是多发性硬化症双胞胎和未受影响双胞胎之间最显著的变化 (图 1b)。在固有淋巴细胞中，患有多发性硬化症双胞胎的 NK 细胞中 CCR6 表达增加，CXCR3 和 CD25 的表达减少；NKT 细胞节点中 CCR6 的表达降低 (图 3a)。CD4+效应记忆 T 细胞 (TEMRA) 节点中 CXCR3 表达显著降低，而 CD69 表达显著升高 (图 3b)。

在双胞胎队列中，最主要的变化在 TH 细胞节点。8 个簇是以明显地高表达 CD25 (IL-2 受体高亲和链) 为特征的初始 TH 细胞，其中一个节点 CCR4 表达增加，一个节点 CD127 表达减少 (图 3b)。初始 TH 细胞亚群中 CD25 高表达代表了多发性硬化症双胞胎循环免疫细胞中最普遍的免疫改变。转录组和伪时间分析进一步表明，该群体处于移行差异状态，初始标记 (CD45RA 和 CCR7) 下调和记忆相关蛋白质 (CD45RO 和 CD25) 上调。

图 3.  患有多发性硬化症双胞胎的淋巴细胞变化。a, 固有淋巴细胞变化；b,TH 细胞变化：高表达 CD25。

细胞因子——初始 T_H 细胞的 IL-2 增加

接下来作者研究了多发性硬化症双胞胎移行 TH 差异状态节点中 CD25 表达增加的功能意义。使用 PMA(PKC 激活剂) 和离子霉素对临床表型不一致的同卵双胞胎的 PBMCs 进行刺激，利用含有 12 细胞因子标记物的 panel，分析细胞因子和转运相关标记物变化情况 (图 3a)。TH 细胞节点表现出初始表型，其特征是 CD25 及其配体 IL-2 表达增加 (图 3b)。通过扩展残疾状态量表 (EDSS) 评估双胞胎患者多发性硬化症的严重程度，发现移行 TH 细胞节点中 IL-2 表达差异与多发性硬化症的严重程度存在很强的正相关，且与处于复发缓解期多发性硬化症 (RRMS) 的双胞胎相比，继发性进行性多发性硬化症 (SPMS) 的双胞胎 IL-2 表达显著升高 (图 3c)。

图 4.  患有多发性硬化症双胞胎的细胞因子变化。a, PBMCs 以抗原非依赖的方式被激活，发现 CD25 高表达 TH 细胞节点，并分析其细胞因子和转运特征变化；b, 差异状态节点细胞中 CD25 和 IL-2 的表达水平；c, IL-2 表达与多发性硬化症双胞胎扩展残疾状态量表 (EDSS) 的相关性。

这项研究作者巧妙地设计实验值得借鉴：1）选取多发性硬化症临床表型不一致的同卵双胞胎，排除遗传和早期环境因素的影响，从而发现环境因素影响的免疫特征；2）利用质谱流式技术在单细胞水平收集 59 个参数信息，全面深入分析免疫细胞表型和功能；3）采用 Live Barcode 技术，同时染色和采集配对双胞胎样本数据，降低样本间的实验偏差，从而发现初始 TH 细胞中整体表达相对较低的 CD25，在临床表型不同的双胞胎间的差异，此特征为多发性硬化症最显著变化；4）独特的人工智能算法，识别出 1400 个免疫特征，并发现 18 个差异特征，揭示独特环境影响驱动的特异性免疫效应。

Fluidigm 公司研发的质谱流式技术是一种高通量单细胞蛋白质分析技术，利用金属元素作为抗体的标签，以质谱作为检测手段，可同时分析单细胞表面和内部的 50 多种标志物，由于采用特殊的金属元素作为检测信号，背景信号极低，彻底解决传统流式的荧光串色的问题，并在多领域得到广泛应用。

参考文献：

1.    Florian Ingelfinger, Lisa Gerdes et al. Twin study reveals non-heritable immune perturbationsin multiple sclerosis. Nature, 16 February 2022 DOI: 10.1038/s41586-022-04419-4